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Se crio en Columbia (Carolina del Sur) y se licenció en química en el Georgia Institute of Technology. En mil novecientos sesenta y seis se trasladó a California, para estudiar bioquímica, logrando un doctorado en la especialidad bajo la dirección de J. B. Neilands en la Universidad de Berkeley.


En mil novecientos setenta y dos se trasladó a Kansas siguiendo a su esposa, y logró empleo como estudioso en cardiología pediátrica, adquiriendo capacitación en biología. Roto su matrimonio, volvió a California, trabajando un tiempo en la Universidad de la ciudad de San Francisco, como estudioso en química farmacéutica, en el campo de las endorfinas. En mil novecientos setenta y nueve fue contratado por la compañía californiana Cetus Corporation, donde trabajaba con oligonucleótidos (moléculas cortas de ADN o bien ARN).


En mil novecientos ochenta y cinco, mientras que proseguía trabajando en Cetus, desarrolló la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa, (PCR en sus iniciales en inglés), una de las técnicas centrales en biología molecular, que deja la amplificación de una zona concreta de ADN utilizando nucleósidos trifosfatados y una polimerasa de ADN. La idea de multiplicar una hebra de ADN millones de veces le vino en mil novecientos ochenta y tres mas no persuadió a sus colegas de la compañía, con lo que debió probar por sí solo la aplicabilidad de la técnica. La versión de la técnica desarrollada en un inicio por Mullis, si bien eficiente, era poco eficaz, hasta el momento en que se le ocurrió emplear polimerasas del ADN termoestables, extraídas de microorganismos termofílicos, en un inicio la polimerasa llamada Taq, proveniente de Thermus aquaticus.


Por esta invención, de gran valor en biotecnología y como herramienta de investigación científica y forense, en mil novecientos noventa y tres recibió el Premio el país nipón y el Premio Nobel de Química, compartido con el canadienseMichael Smith. Cetus, la compañía de Mullis, le dio una recompensa de diez dólares estadounidenses por la invención de la PCR y después vendió la patente por 300.000.000 de dólares estadounidenses a Roche Molecular Systems, una sección de la esencial compañía farmacéutica Hoffmann-La Roche.


La PCR ha sido el fundamento de múltiples revoluciones en campos prácticos, como la identificación del origen de muestras de sangre o bien saliva (a los que recurre de forma masiva la ciencia forense), y la secuenciación de genes humanos o bien de otros organismos. La secuenciación genética era hasta ese momento un proceso muy complicado, aplicable solo cuando se podían conseguir de forma natural muchas copias del mismo ADN. La PCR transformó en una rutina la investigación de la secuencia genética, dejando la lectura completa del genoma humano, como de muchos organismos que se toman como modelos en la investigación de diferentes inconvenientes biológicos. La técnica ha tolerado asimismo investigar la filogenia (historia evolutiva) equiparando las secuencias genéticas de diferentes alcurnias, que por su parte es el fundamento de un planeta de hipótesis científicas del máximo interés.


En un orden más anecdótico, sin la PCR carecería de sentido el razonamiento de la novela Parque Jurásico de Michael Crichton, llevada al cine en mil novecientos noventa y tres bajo la dirección de Steven Spielberg, donde se reconstruye el genoma de animales extintos desde restos mínimos de su sangre preservada en ámbar.


Mullis ha dicho que la busca inacabable de más subvenciones y la permanencia en dogmas establecidos ha hecho daño a la ciencia. Piensa que "la ciencia es practicada por personas cuyos pagos dependen de lo que van a descubrir", y no de lo que verdaderamente generan. Mullis ha sido descrito como un "estudioso impaciente y también impetuoso" que halla hastiado el trabajo de laboratorio rutinario y en cambio piensa sobre su investigación mientras que conduce y surfea. Ideó la reacción en cadena de la polimerasa mientras que conducía en la carretera


En su autobiografía de mil novecientos noventa y ocho, Mullis expresó su disconformodidad con la evidencia a nivel científico que apoya el cambio climático y el agotamiento de ozono, la patentiza que el SIDA causa el sida y aseveró su creencia en la astrología. Mullis mantiene que el cambio climático y la conexión VIH/sida se deben a una conspiración de ecologistas, agencias gubernativos y científicos que procuran conservar sus carreras y conseguir dinero, en vez de evidencia a nivel científico. Mullis ha creado polémica por su asociación con el sobresaliente negacionista del sida Peter Duesberg y aseveró que el sida es un diagnóstico arbitrario utilizado solamente cuando se hallan anticuerpos contra el SIDA en la sangre de un paciente. El acuerdo médico y científico es que la hipótesis de Duesberg es seudociencia, puesto que se ha probado conclusivamente que el SIDA es la causa del sida, y que el calentamiento global ocurre debido a actividades humanas. Seth Kalichman, estudioso del sida y autor de Denying AIDS,admite que "semeja extraño incluir un distinguido con el nobel entre el quién es quién de los seudocientíficos del sida". Mullis asimismo escribió el prefacio del libro What If Everything You Thought You Knew About AIDS Was Wrong? de Christine Maggiore, una negacionista del sida SIDA positivo quien, así como su hija, murió de una enfermedad relacionada con el sida. Un artículo de The New York Times alistó a Mullis como uno de múltiples científicos que, tras encontrar el éxito en su área de investigación, entonces efectúan aseveraciones inmotivadas, en ocasiones peculiares, en otras áreas. Un artículo de Skeptical Inquirer describió a Mullis como un "negacionista del sida con credenciales científicas que jamás ha hecho una investigación científica sobre el SIDA o bien el sida."


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